Блог

Jun 26, 2023

Пиксель

Scientific Reports, том 13, номер статьи: 2934 (2023) Цитировать эту статью 943 Доступ 3 Подробности об альтметрических метриках Фактическое взаимодействие между сигнальными видами в клеточных процессах часто

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 2934 (2023) Цитировать эту статью

943 Доступа

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Фактическое взаимодействие между сигнальными видами в клеточных процессах часто более важно, чем уровни их экспрессии. Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — популярный инструмент для изучения молекулярных взаимодействий, поскольку он очень чувствителен к близости в диапазоне 2–10 нм. Количественный (3-кубовый) FRET со спектральной поправкой на переливы - это экономически эффективный и универсальный подход, который может применяться в проточной цитометрии и различных методах флуоресцентной микроскопии, но ему могут препятствовать различные уровни автофлуоресценции. Здесь мы внедрили попиксельную коррекцию автофлуоресценции в микроскопических измерениях FRET, используя бесклеточные калибровочные стандарты, лишенные автофлуоресценции, которые позволяют правильно определять все спектральные коэффициенты перелива. Мы также представляем плагин ImageJ/Fiji для интерактивного анализа отдельных изображений, а также автоматического создания количественных карт эффективности FRET из больших наборов изображений. Для проверки мы использовали модели FRET на основе шариков и клеток, охватывающие диапазон отношений сигнала к автофлуоресценции и эффективности FRET, и сравнили этот подход с традиционной коррекцией средней автофлуоресценции/фона. Попиксельная коррекция автофлуоресценции оказалась превосходной по точности результатов, особенно для образцов с пространственно изменяющейся автофлуоресценцией и низким соотношением флуоресценции к автофлуоресценции, причем последнее часто имеет место для физиологических уровней экспрессии.

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это бесстолкновительный безызлучательный перенос энергии между флуоресцентным донорным красителем и спектрально адекватным акцепторным красителем, который для практических целей часто выбирается флуоресцентным1. Начиная с конца 1960-х годов, FRET постепенно стал популярным инструментом для определения близости между макромолекулами. Эффективность передачи энергии (E) является функцией обратной шестой степени расстояния между донорным и акцепторным красителями, которое быстро меняется в диапазоне 2–10 нм. Этот диапазон чувствительности служит основой для установления и сравнения взаимодействий на молекулярном уровне даже в оптических приборах, которые в противном случае ограничены меньшей разрешающей способностью из-за дифракции2. Даже несмотря на то, что быстро совершенствующиеся методы сверхразрешения снижают предел разрешения все ниже и ниже, для методов FRET остается еще много места3. Существует широкий спектр подходов к измерению FRET в микроскопии4: от измерений отдельных молекул5,6 до ансамблевых подходов, многие из которых не требуют дорогостоящего оборудования и/или не разрушают образец7,8,9. К ним относятся ратиометрические методы, которые лучше всего использовать в постоянно расширяющейся области биосенсоров на основе флуоресцентных белков с известной донорно-акцепторной стехиометрией10, а также методы количественного измерения, которые дают калиброванную эффективность FRET, независимую от донорно-акцепторной стехиометрии11. Из них визуализация времени жизни флуоресценции (FLIM) представляет собой по своей сути количественный метод, но требует передового оборудования12,13, в то время как FRET с коррекцией спектрального перелива (или трехкубовый) является экономически эффективным и универсальным подходом, который может применяться в проточной цитометрии и обычных флуоресцентная микроскопия. В отличие от также популярного метода акцепторного фотообесцвечивания14,15, его также можно использовать в сочетании с покадровым и трехмерным анализом изображений11,16.

Основным ограничением каждого метода измерений FRET является соотношение сигнал/шум (SNR). SNR — это ожидаемое значение сигнала, деленное на его стандартное отклонение. Здесь шум всех измеренных интенсивностей флуоресценции, используемых в дальнейших расчетах, распространяется на эффективность FRET. Предполагая пуассоновское распределение обнаруженных фотонов на пиксель с ожидаемым значением λ, если систематический шум пренебрежимо мал, SNR равно √λ, поэтому ожидается, что более низкие интенсивности в большей степени увеличат неопределенность определенного FRET E. Образцы с низким SNR можно сделать более пригодными для FRET-анализа за счет повышения квантовой эффективности и фотостабильности флуоресцентных красителей, использования более эффективного обнаружения17, оптимизации пар красителей FRET18,19, а также за счет усовершенствованных математических и статистических подходов20,21,22. 23. Использование метода с коррекцией спектрального перелива обычно позволяет сделать вывод о существующих молекулярных взаимодействиях, когда наблюдается эффективность FRET ~ 5% или выше.